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上海交大陶生策团队开发新型邻近标记分子-蛋白质互作鉴定技术—SPIDER
蛋白质与其他生物分子的相互作用（如蛋白质-蛋白质相互作用PPI，蛋白质-核酸相互作用PNI，蛋白质-小分子相互作用PSMI等）在几乎所有生物过程中起着关键作用。识别这些相互作用对于我们理解生命系统在分子水平上的运作至关重要。有许多经典的方法用于蛋白质-生物分子相互作用研究。然而，它们大多数不适用于弱、瞬时或者基于膜的蛋白质相互作用研究。原因是这些相互作用大多是非共价的，在富集洗涤过程中很难在保持特异性的同时有效地保留相互作用。为了解决这一关键挑战，需要一种能够轻松、高效、特异地将非共价结合转化为共价结合的方法。
2023年3月22日，欧宝app官方网站下载陶生策团队在SCIENCE CHINA Life Sciences上在线发表题为Specific Pupylation as IDEntity Reporter (SPIDER) for the Identification of Protein-Biomolecule Interactions的研究论文。该团队在研究结核分枝杆菌的过程中，意外发现了Pupylation途径的一种基于底物的邻近标记活性。具体而言，这种活性是由底物（Pup）与靶蛋白的邻近引发的，而不是由酶（如Pup-IT的PafA、BioID的BirA和APEX的Peroxidase）的邻近引发的。该研究将基于底物的邻近标记活性与亲和力极高的链霉亲和素（SA）-生物素相互作用相结合，开发了Specific Pupylation as IDEntity Reporter（SPIDER）方法。
在执行SPIDER实验之前，仅需准备生物素化标记的诱饵分子和目标样品（纯化蛋白、细胞裂解物或细胞）。在SPIDER反应后，诱饵分子和目标蛋白之间的非共价结合被转化为目标蛋白和SA之间的共价连接(图1)。随后目标蛋白可以被生物素琼脂糖亲和富集质谱鉴定。
SPIDER邻近标记系统
该团队系统地评价了SPIDER在鉴定蛋白质-生物分子互作中的应用，包括PPI、PNI、PSMI以及配体-细胞表面受体结合等。针对PPI，全局鉴定了原核蛋白去乙酰化酶CobB的新型底物。针对PNI，鉴定到了m6A的新的潜在阅读器SRSF7，并揭示了THP-1细胞分化前后的mRNA-蛋白质相互作用组。针对PSMI，全局性鉴定了Lenalidomide的相互作用蛋白质。此外，还在活细胞表面原位探索了SARS-CoV-2特异性受体的分布。
SPIDER和其它标记方法比较具有一定优势。首先，SPIDER可普遍适用于生物分子，并仅需对诱饵分子（目标分子）进行生物素化标记，该过程可以在体内或体外进行合成或标记。其次，SPIDER具有AP-MS的简单易操作特点（上图）。不必担心诱饵分子的降解（尤其是RNA）等。此外，由于互作转化为共价键，SPIDER的结果可以通过监测SA-蛋白质的共价物，轻松地在凝胶上实现可视化，这可大大简化目标分子与蛋白质相互作用的验证。最后，由于SPIDER的两种关键试剂（PafA和SA-PupE）可以标准化大量制备，并可冷冻干燥保存，在此基础上可大大简化操作，从而可方便后续进行高通量的SPIDER实验研究大量不同诱饵分子的相互作用蛋白。
本项研究的第一作者为欧宝app官方网站下载江何伟博士，陈红博士生，郑云萧，王雪宁，孟庆峰博士，谢金和张炯博士。通讯作者为欧宝app官方网站下载陶生策研究员、董佳家研究员和北京大学裴剑锋研究员。该研究还得到了中科院大连化物所王方军研究员和重庆医科大学党永军教授的大力支持。